Pierwotny niedobór odporności spowodowany przez mutacje w genie kodującym podjednostkę CD3- receptora limfocytu T cd

Autopsja wykazała obustronne bronchopneumonia, prawdopodobnie z powodu wirusa (para-grypy 3) i gigantycznych komórek charakterystycznych dla zapalenia płuc Hechta. Brat (III-2), obecnie 10-letni i zdrowy, był wcześniej przyjęty do szpitala z łagodną niewydolnością oddechową (w wieku 15 miesięcy, 17 miesięcy i 6 lat). Dziecko jest pod każdym względem normalne, z wyjątkiem fenotypu i funkcji komórek T i poziomów IgG2 (13 mg na decylitr [0,13 g na litr]), z których wszystkie są porównywalne z tymi z probandu 6, 7 Wszystkich innych członków rodziny ( Fig. 2B) są zdrowe i mają normalną ekspresję kompleksu receptor-CD3 limfocytów T. Jednak ojciec probanda (II-8) ma również niskie poziomy IgG2 (8 mg na decylitr [0,08 g na litr]). Analiza cząsteczek powierzchniowych T-Lymphocyte
Limfocyty T barwiono na próbkach krwi pełnej (Q-Prep Epics, Coulter Electronics, Hialeah, Fla.) Z przeciwciałami monoklonalnymi traktowanymi fluoresceiną, które rozpoznają cząsteczki powierzchni komórki T (CD2, CD3, CD4, CD8 i receptor komórek T) . Kwantyfikację barwienia powierzchni 5000 żywotnych limfocytów przeprowadzono w sorterze komórek Epics-C (Coulter), jak opisano wcześniej.
Izolacja i analiza posłańca RNA i genomowego DNA
Figura 3. Figura 3. Analiza sekwencji mRNA CD3-.. Pokazano lokalizację odpowiednich fragmentów cDNA CD3-. (otrzymanego jako odwrotna kopia mRNA) i odpowiadającej im sekwencji aminokwasowej. Zmutowane ojcowskie i matczyne nici mRNA CD3-. otrzymane z limfocytów T z członka rodziny III-2 ze starterami A i B porównano z odpowiednimi normalnymi sekwencjami. W ojcowskim cDNA adeninę oczekiwaną w pierwszym eksonie kodującym zastąpiono guaniną (strzałką), zmieniając kodon inicjatora metioniny na kodon waliny. W matczynym cDNA usunięto pierwsze 17 par zasad eksonu 3 (obszar w nawiasie w normalnej sekwencji), powodując przesunięcie w ramce odczytu i pojawienie się kodonu stop. Wyniki te potwierdzono analizą dot blot (dane niepokazane) z podkreślonymi specyficznymi dla mutacji oligonukleotydami, jak również ich normalnymi odpowiednikami. Przynależność ojcowska i macierzyńska sekwencji została oparta na wynikach pokazanych na rysunku 2B.
Całkowity RNA z limfocytów T wyizolowano jak opisano uprzednio.9 Komplementarne nici cząsteczki informacyjnego RNA (mRNA) (komplementarny DNA [cDNA]) otrzymano przez odwrotną transkrypcję zgodnie ze wskazówkami w dostępnym komercyjnie zestawie (Boehringer, Mannheim, Niemcy). ). Z tego surowego ekstraktu zawierającego wszystkie mRNA komórek T, specyficzny dla CD3-y zamplifikowano z reakcją łańcuchową polimerazy. Dwa oligonukleotydy (A i B) zastosowano jako startery specyficzne dla nieulegających translacji końców mRNA CD3-.. (Fig. 3). 11 Otrzymano w ten sposób fragment cDNA, który zawierał część kodującą mRNA CD3-.. Całkowity genomowy DNA z leukocytów krwi obwodowej został również wyizolowany zgodnie z opisem 12. Z tego surowego ekstraktu wybrane fragmenty genu CD3-. zostały zamplifikowane przez reakcję łańcuchową polimerazy.10 Dwa zestawy oligonukleotydów zastosowano jako startery, w zależności od regionu genu CD3-. do zbadania (Fig. 2A): jeden zestaw (C i D) zastosowano do zbadania regionu kodonu inicjatora, a drugi zestaw (E i F) zastosowano do badania regionu między intronem 2 a ekson 3, w którym wystąpił splicing. Zamplifikowane cDNA i genomowe fragmenty DNA kodujące CD3-. analizowano następnie jedną lub obiema z następujących metod: analizę sekwencji przy użyciu standardowych technik10 i analizę dot blot przy użyciu specyficznych oligonukleotydów. .9
Wyniki
Fenotyp komórek powierzchniowych limfocytów T krwi obwodowej
Dwóch braci mających podobną wadę w ekspresji kompleksu receptora komórek T CD3, ale z różnym stopniem zmian immunologicznych, badano jako pierwsze.5 Poziom ekspresji kompleksów receptora limfocytów T-CD3 na powierzchni T limfocyty z probandu (III-3) i jego chorego rodzeństwa (III-2) były znacznie niższe niż w normalnych komórkach kontrolnych lub limfocytach T od innych członków rodziny, jak pokazano na Figurze 2B (wskazano procent limfocytów CD3 +)
[hasła pokrewne: larimax, układ szkieletowy człowieka, olx strzelin ]