Aktywność syntezy tlenku azotu w niemowlęcym hipertroficznym zwężeniu odźwiernika ad

Preparaty inkubowano w roztworze 10 mM buforu fosforanu sodu zawierającego 2,5 mM NADPH (Sigma), mM nitroblue tetrazolium (Sigma) i 10 procent dimetylosulfotlenku w 37 ° C przez 15 do 90 minut. Skrawki następnie poddano obróbce w kierunku immunofluorescencji za pomocą poliklonalnej surowicy odpornościowej tau, w celu oznakowania jelitowego układu nerwowego. Tau to rodzina białek związanych z mikrotubulami neuronowego cytoszkieletu21. Wiadomo, że antyserum reaguje z komórkami jelitowego układu nerwowego u niemowląt.22 Używana antyserum B19 tau była hojnym darem od Dr. JP Briona (Bruksela, Belgia). Podwyższono ją u królika za pomocą oczyszczonych bydlęcych białek tau i przebadano pod kątem immunoreaktywności wobec białek ludzkiego mózgu i oczyszczonego tau metodą Western blotting i wobec syntetycznych peptydów tau za pomocą enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego.21 Skrawki inkubowano przez godzinę z 5% roztworem normalnej surowicy świńskiej (Dakopatts, Glostrup, Dania) w 0,01 M roztworze soli buforowanym TRIS (pH 7,6) zawierającym 0,1% Triton X-100. Skrawki następnie inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej z surowicą odpornościową w rozcieńczeniu 1: 500, płukano w soli fizjologicznej buforowanej TRIS i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej ze sprzężoną z fluoresceiną świńską immunoglobuliną przeciwdrgawkową (Dakopatts) w rozcieńczeniu 1%. : 30. Po płukaniu solą fizjologiczną buforowaną TRIS skrawki umieszczono w glicerolu zawierającym 20% Gelvatolu (Monsanto, St. Louis) i 10% trietylenodiaminy (Janssen Chimica, Beerse, Belgia) jako środka przeciwdziałającego uwalnianiu i badano pod mikroskopem Axiophot Zeiss wyposażonym w epifluorescencja.
Aby zapewnić kontrolę ujemną w badaniach immunohistochemicznych, pominięto pierwszorzędowe przeciwciało. W badaniach histochemicznych pominięto NADPH, aby zapewnić kontrolę negatywną. Weryfikowaliśmy, że wybarwienie Daphaphase NADPH jest zawsze obecne w strukturach zidentyfikowanych histologicznie lub immunohistologicznie. Podstawienie NADH (dezaforaza NADH) dla NADPH w protokole histochemicznym dało niespecyficzny wzór barwienia, wyraźnie różny od tego w reakcji na daphafazę NADPH (dane nie pokazane). Reaktywność tkanki z surowicą odpornościową tau nie została zmieniona przez wcześniejsze histochemiczne barwienie dla daphafazy NADPH. Reakcję diaphorase obserwowano tylko w strukturach neuronów pozytywnych w tau i w naczyniach krwionośnych. Gęste, niebieskie odkładanie się reakcji diaphorase czasem maskowało sygnał fluorescencyjny w ciałach komórkowych niektórych neuronów jelitowych, ale problem ten nie występował w włóknach nerwowych. Stała tkanka porównywała korzystnie ze świeżą tkanką pod względem zachowania histologicznego i znakowania immunohistologicznego jelitowego układu nerwowego. Wzorzec histochemicznego wybarwiania dla diaphorase NADPH był identyczny w świeżych i stałych materiałach. Jednak lepszy stosunek sygnału do szumu uzyskano przy pomocy utrwalonej tkanki, chociaż optymalny czas inkubacji był dłuższy (75 minut, w porównaniu z 30 minutami dla świeżej tkanki).
Wyniki
Normalny odźwiernik
Ryc. 1. Histochemiczna lokalizacja aktywności diaforyzy NADPH, znanej również jako syntaza tlenku azotu, i barwienie immunofluorescencyjne Tau tkanki odźwiernikowej
[hasła pokrewne: komórki macierzyste kraków, olx ostrowiec sw, przychodnia łomżyńska bydgoszcz rejestracja ]